Колонизация корневой системы огурца бактериями Pseudomonas fluorescens

09 Марта 2021, 15:22

Научно-практический журнал БИОМ, №1 2018

• Введение
• Методы защиты во время стресса у растения
• Колонизация корневой системы огурца Pseudomonas fluorescens
• Методика проведения экспериментов
• Результаты эксперимента

В проведённом исследовании был изучен процесс колонизации клетками Pseudomonas fluorescens штамм поверхности корневой системы растения огурца сорта Атлет гибрида F1. Также была предложена технологическая схема применения данных микроорганизмов.

Важным этапом атаки фитопатогенного микроорганизма на растение является процесс колонизации клетками поверхности корневой системы растения. Результатом колонизации является либо образование пленки фитопатогенного микроорганизма на поверхности корня, либо «сорбция» отдельных клеток на поверхности корня. Вслед за этим фитопатогенный микроорганизм начинает выделять низкомолекулярные соединения, которые, по-видимому, являются ядами для клеток корня растения, и далее выделяет группу ферментов литического ряда, которые разрушают сначала внешнюю оболочку корня, а затем поражают и сами клетки корня, и растение в целом.

В соответствии с теорией фитопатогенеза [1] , само растение способно на этих стадиях противостоять атаке фитопатогенного микроорганизма целым комплексом действий. Так, выделяемые растением экссудаты, при их метаболизме клетками фитопатогенного микроорганизма, блокируют синтез литических ферментов, в соответствии с классической теорией — регулирования ферментативной активности по механизму катаболитной репрессии. Растение способно выделять протеолитические ферменты, которые разрушают литические ферменты, выделяемые фитопатогенными микроорганизмами. Также растение способно выделять ингибиторы литических ферментов и низкомолекулярные соединения, обладающие противомикробным действием – фитоалексины, аналоги антибиотиков.

Последовательность запуска механизмов защиты растения от фитопатогенов может быть различной, но известно, что все эти механизмы работают только при условиях благоприятных для нормального роста растения и экссудации им корневых выделений.

При наступлении стресса, вне зависимости от его причин, экссудация корневых выделений резко меняется как по составу, так и по концентрациям, и даже может полностью прекратиться. В этот момент корневая система растения становится полностью беззащитна от воздействия фитопатогенного микроорганизма, колонизировавшего корневую систему и разросшегося за счет метаболизма экссудатов. И фитопатогенный микроорганизм попадает в растение.

Методы защиты во время стресса у растения

Существуют ли методы защиты корневой системы растения во время стресса от воздействия фитопатогенных микроорганизмов? По нашему мнению, существует несколько методов защиты корневой системы растения от фитопатогенной микрофлоры, особенно в период стрессовых для растения условиях. В данной статье мы постараемся рассмотреть один из этих методов, связанный с внесением и использованием биологических препаратов.

Действующим началом многих препаратов являются живые клетки микроорганизмов, споры или формы, содержащие метаболиты различных микроорганизмов. Количество видов микроорганизмов, разрешенных и используемых в биологических препаратах для защиты растений, незначительно и ограничено во многом из-за бюрократических трудностей введения тех или иных микроорганизмов в оборот. Но даже для столь малого количества видов микроорганизмов нет четкого понимания некоторых принципиальных методов оценки их свойств. К таким свойствам, на наш взгляд, стоит отнести:

• способность микроорганизмов, входящих в состав биологических препаратов средств защиты растений, метаболизировать экссудаты корневой системы с максимальной скоростью и до минимальных концентраций;
• способность колонизировать корневую систему растения и расти вместе с ней в объеме субстрата;
• способность подавлять развитие фитопатогенной микрофлорой при условиях метаболизма экссудатов корневой системы конкретного растения.

Безусловно, для оценки этих свойств микроорганизмов потребуется создание новых методов и технологий исследований, но это является необходимым шагом в развитии системы биологической зашиты растений.

Колонизация корневой системы огурца Pseudomonas fluorescens

Данная работа посвящена анализу результатов по колонизации корневой системы огурца на ранних стадиях его развития микроорганизмом Pseudomonas fluorescens .

В работе использовали семена огурца сорта Атлет гибрида F1 компании Гавриш, в качестве объектов исследования был использован штамм Pseudomonas fluorescens номер В001.

Методика проведения экспериментов заключалась в следующем. Микроорганизм выращивали глубинным способом на питательной среде Кинга соответствующего состава [2] в аэробных, стерильных условиях, при 25–280С в течении 2 суток. Суспензии клеток использовали для приготовления рабочего раствора, который готовили, разбавляя исходную суспензию физиологическим раствором так, чтобы концентрация клеток в нем была 106 КОЕ/мл.

Рабочие растворы использовали для нанесения клеток на семена. Для этого партию семян помещали на 2-3 минуты в соответствующую суспензию идалее помещалисемена огурцов в установку для выращивания.

Огурцы выращивали в специально разработанной системе, представляющей из себя стеклянные колонки диаметром 5 см и высотой 15 см с впаянными в них фильтрами Шотта. Колонки были заполнены на ½ объема вермикулитом со средним размером частиц 2-2.5 мм, сверху кколонке через ватно-марлевый тампон по шлангу подводился раствор для полива. Полив проводили модифицированным раствором Хогланда [3] дискретно с заданной скоростью. Одновременно в системе работало 4 описанных установки. Вся система для выращивания стерилизовалась в сборе в автоклаве. На наш взгляд, описанная выше схема проращивания семян огурца наиболее полно соответствует проращиванию в минераловатном субстрате с присыпкой Агровермикулитом.

Методика проведения экспериментов

Методика проведения эксперимента заключалась в следующем: семена огурца стерилизовали и далее обрабатывали в суспензии Pseudomonas fluorescens и помещались в установки. Вермикулит в установке смачивали стерильным раствором. Семена сажали на 1 см в вермикулит. Вся система термостатировалась при 25 0С. Через определенные интервалы времени одна из установок останавливалась и из неё аккуратно извлекалось семя вместе с корневой системой, отряхивалось от вермикулита и в стерильных условиях переносилось на агаризованную среду, которая в свою очередь выдерживалась в термостате. Выросшие на агаризованной среде колонии микроорганизмов фотографировали и в дальнейшем микроскопировали препараты, приготовленные из образцов с чашек Петри. Каждая последующая установка останавливалась через определенное время и с проросшим семенем огурца проводили аналогичные манипуляции.

На первом этапе исследований в установке было проведено проращивание семян огурца сорта Атлет в стерильных условиях. Это было необходимо для определения возможности работы установки и проращивания в ней семян и возможности проведения процесса в контролируемых стерильных условиях. Одновременно, часть семян проращивали во влажной камере по стандартной методике [4] Проведение эксперимента по описанной выше методике показало, что семена прорастают в установке аналогично тому, как они прорастают во влажной камере. Но, при этом корневаясистема располагается в объеме вермикулита не хаотично, а ориентировано к низу. Время от момента набуханиядо фазы развернутых семядолей (период мезотрофного проростка) в наших экспериментах составил ориентировочно 5 суток. Кроме того, было подтверждено, что система, используемая для исследований, позволяет в ходе эксперимента 5 и более сутокподдерживать процесс в стерильных условиях.

Следующим этапом исследований было изучение колонизации корневой системы огурца и семядолей клетками Pseudomonas fluorescens. Выращивание семян огурца Атлет, обработанных клеткамиPseudomonas fluorescens, проводили по аналогичной схеме. После извлечения проростка из системы культивирования он помещался на агаризованную среду Кинга и переносился в термостат.

На фото1 приведены характерные результаты выросших через сутки колоний микроорганизмов.

Как видно на фото 1 , характерные, однородные колонии расположены равномерно по всей длине корневой системы проростка огурца. Последующее микрокопирование колоний при помощи фиксированных окрашенных препаратов подтвердило, что по всей длине корневой системы были обнаружены исходные клетки Pseudomonas fluorescens . Аналогичные результаты были получены для всех образцов семян, извлеченных из установки с интервалом в одни сутки. Таким образом можно говорить о том, что клетки Pseudomonas fluorescens , нанесенные на семя огурца, при его прорастании растут вместе с корневой системой, по всей видимости покрывая ее. Вторым не менее интересным результатом является то, что ни на проростке, ни на семядолях во всех образцах мы не обнаружили никаких клеток, в том числе и клеток Pseudomonas fluorescens .

Полученные результаты показывают, что клетки Pseudomonas fluorescens эффективно колонизируют корневую систему огурца сорта Атлет и растут вместе с ростом корневой системы. Это может происходить только за счет выделений, образующихся при прорастании семян, скорее всего на этой стадии преобладают сахара, ди- и трикарбоновые кислоты, аминокислоты. А вот полное отсутствие микроорганизмов на стебле и семядолях проростка огурца свидетельствует о том, что их развитие не только невозможно в виду отсутствия экссудатов, которые в данной части растения не выделяются, но и скорее всего их развитие ингибируется продуктами метаболизма растения. Что это за вещества (фитоалексины или иные органические соединения или комплекс литических ферментов) пока не ясно, но ясно, что при обработке семян по принятой нами методике часть микроорганизмов просто неизбежно должна была контактировать с семядолями растения. Безусловно данные результаты требуют еще осмысления и проведение дальнейших исследований.

Бактерии Pseudomonas fluorescens обладают фунгицидными свойствами и соответственно необходимо было исследовать, как проявляются эти свойства у клеток, выросших на поверхности корневой системы проростков огурца.

Для этого были проведены эксперименты, в которых семена огурца обрабатывались суспензией клеток Pseudomonas fluorescens , помещались в систему выращивания, а далее, через сутки после того, как семена начинали прорастать, в систему стерильно вносили суспензию спор Fusarium oxysporum . Этим мы моделировали появление фитопатогенного микроорганизма рядом с прорастающим семенем.

В качестве контроля был взят образец семян, не обработанный суспензией клеток Pseudomonas fluorescens . Как и в предыдущем эксперименте, через каждые сутки одно из растений изымали из установки для определения колонизации корневой системы высевом на агаризованную среду. Контрольный вариант анализировали в конце эксперимента. Все остальные параметры эксперимента (температура, режим полива) оставались прежними.

На фото 2 показан отпечаток корневой системы огурца, на семена которого были нанесены клетки Pseudomonas fluorescens , а затем после суток проращивания клетки Fusarium oxysporum . Как видно на фотографии вдоль корневой системы проростка практически нет колоний Fusarium oxysporum , зато вся корневая система покрыта колониями Pseudomonas fluorescens . В контрольном варианте вся корневая система проростка огурца покрыта Fusarium oxysporum (фото 3).

Таким образом из эксперимента видно, что предварительная обработка семян огурца сорта Атлет F1 клетками Pseudomonas fluorescens обеспечивает равномерное распределение клеток по корневой системе проростка несмотря на то, что их рост происходит против градиента кислорода. Это обусловлено тем, что вдоль прорастающей корневой системы находится зона с максимальной концентрацией экссудатов.

Отсутствие заражения корневой системы Fusarium oxysporum в варианте предварительной обработки семян клетками Pseudomonas fluorescens скорей всего объясняется совокупностью свойств клеток Pseudomona sfluorescens :

• высокой скоростью метаболизма экссудатов корневой системы огурца, очень низкой остаточной концентрацией экссудатов;
• колонизацией вдоль растущей корневой системы проростка и скорее всего образованием многослойной микробной пленки;
• стимулирование роста корневой системы за счет образования активных для растения биологических соединений;
• достаточно высокой фунгицидной активностью против грибов рода Fusarium.

1. Метлицкий Л.В. Как растения защищаются от болезней. – Наука, 2013.

2. Нетрусов А.И., Егорова М.А., Захарчук Л.М. Практикум по микробиологии: Учеб. пособие/Под ред. А.И.Нетрусова. – 2005.

3. Hoagland D. R. et al. The water-culture method for growing plants without soil //Circular. California agricultural experimentstation. – 1950. – Т. 347. –2nd edit.

4. ГОСТ 12038-84. Семена сельскохозяйственных культур. Методы определения всхожести (с Изменениями № 1, 2)

5. Горюнова О.Б., Марквичев Н.С. Профилактическая защита рассады от болезней с умом. Как? // Биом. – 2017. –№1. –Москва

Колонизация корневой системы огурца бактериями Pseudomonas fluorescens

09 Марта 2021, 15:22

Научно-практический журнал БИОМ, №1 2018

• Введение
• Методы защиты во время стресса у растения
• Колонизация корневой системы огурца Pseudomonas fluorescens
• Методика проведения экспериментов
• Результаты эксперимента

В проведённом исследовании был изучен процесс колонизации клетками Pseudomonas fluorescens штамм поверхности корневой системы растения огурца сорта Атлет гибрида F1. Также была предложена технологическая схема применения данных микроорганизмов.

Важным этапом атаки фитопатогенного микроорганизма на растение является процесс колонизации клетками поверхности корневой системы растения. Результатом колонизации является либо образование пленки фитопатогенного микроорганизма на поверхности корня, либо «сорбция» отдельных клеток на поверхности корня. Вслед за этим фитопатогенный микроорганизм начинает выделять низкомолекулярные соединения, которые, по-видимому, являются ядами для клеток корня растения, и далее выделяет группу ферментов литического ряда, которые разрушают сначала внешнюю оболочку корня, а затем поражают и сами клетки корня, и растение в целом.

В соответствии с теорией фитопатогенеза [1] , само растение способно на этих стадиях противостоять атаке фитопатогенного микроорганизма целым комплексом действий. Так, выделяемые растением экссудаты, при их метаболизме клетками фитопатогенного микроорганизма, блокируют синтез литических ферментов, в соответствии с классической теорией — регулирования ферментативной активности по механизму катаболитной репрессии. Растение способно выделять протеолитические ферменты, которые разрушают литические ферменты, выделяемые фитопатогенными микроорганизмами. Также растение способно выделять ингибиторы литических ферментов и низкомолекулярные соединения, обладающие противомикробным действием – фитоалексины, аналоги антибиотиков.

Последовательность запуска механизмов защиты растения от фитопатогенов может быть различной, но известно, что все эти механизмы работают только при условиях благоприятных для нормального роста растения и экссудации им корневых выделений.

При наступлении стресса, вне зависимости от его причин, экссудация корневых выделений резко меняется как по составу, так и по концентрациям, и даже может полностью прекратиться. В этот момент корневая система растения становится полностью беззащитна от воздействия фитопатогенного микроорганизма, колонизировавшего корневую систему и разросшегося за счет метаболизма экссудатов. И фитопатогенный микроорганизм попадает в растение.

Методы защиты во время стресса у растения

Существуют ли методы защиты корневой системы растения во время стресса от воздействия фитопатогенных микроорганизмов? По нашему мнению, существует несколько методов защиты корневой системы растения от фитопатогенной микрофлоры, особенно в период стрессовых для растения условиях. В данной статье мы постараемся рассмотреть один из этих методов, связанный с внесением и использованием биологических препаратов.

Действующим началом многих препаратов являются живые клетки микроорганизмов, споры или формы, содержащие метаболиты различных микроорганизмов. Количество видов микроорганизмов, разрешенных и используемых в биологических препаратах для защиты растений, незначительно и ограничено во многом из-за бюрократических трудностей введения тех или иных микроорганизмов в оборот. Но даже для столь малого количества видов микроорганизмов нет четкого понимания некоторых принципиальных методов оценки их свойств. К таким свойствам, на наш взгляд, стоит отнести:

• способность микроорганизмов, входящих в состав биологических препаратов средств защиты растений, метаболизировать экссудаты корневой системы с максимальной скоростью и до минимальных концентраций;
• способность колонизировать корневую систему растения и расти вместе с ней в объеме субстрата;
• способность подавлять развитие фитопатогенной микрофлорой при условиях метаболизма экссудатов корневой системы конкретного растения.

Безусловно, для оценки этих свойств микроорганизмов потребуется создание новых методов и технологий исследований, но это является необходимым шагом в развитии системы биологической зашиты растений.

Колонизация корневой системы огурца Pseudomonas fluorescens

Данная работа посвящена анализу результатов по колонизации корневой системы огурца на ранних стадиях его развития микроорганизмом Pseudomonas fluorescens .

В работе использовали семена огурца сорта Атлет гибрида F1 компании Гавриш, в качестве объектов исследования был использован штамм Pseudomonas fluorescens номер В001.

Методика проведения экспериментов заключалась в следующем. Микроорганизм выращивали глубинным способом на питательной среде Кинга соответствующего состава [2] в аэробных, стерильных условиях, при 25–280С в течении 2 суток. Суспензии клеток использовали для приготовления рабочего раствора, который готовили, разбавляя исходную суспензию физиологическим раствором так, чтобы концентрация клеток в нем была 106 КОЕ/мл.

Рабочие растворы использовали для нанесения клеток на семена. Для этого партию семян помещали на 2-3 минуты в соответствующую суспензию идалее помещалисемена огурцов в установку для выращивания.

Огурцы выращивали в специально разработанной системе, представляющей из себя стеклянные колонки диаметром 5 см и высотой 15 см с впаянными в них фильтрами Шотта. Колонки были заполнены на ½ объема вермикулитом со средним размером частиц 2-2.5 мм, сверху кколонке через ватно-марлевый тампон по шлангу подводился раствор для полива. Полив проводили модифицированным раствором Хогланда [3] дискретно с заданной скоростью. Одновременно в системе работало 4 описанных установки. Вся система для выращивания стерилизовалась в сборе в автоклаве. На наш взгляд, описанная выше схема проращивания семян огурца наиболее полно соответствует проращиванию в минераловатном субстрате с присыпкой Агровермикулитом.

Методика проведения экспериментов

Методика проведения эксперимента заключалась в следующем: семена огурца стерилизовали и далее обрабатывали в суспензии Pseudomonas fluorescens и помещались в установки. Вермикулит в установке смачивали стерильным раствором. Семена сажали на 1 см в вермикулит. Вся система термостатировалась при 25 0С. Через определенные интервалы времени одна из установок останавливалась и из неё аккуратно извлекалось семя вместе с корневой системой, отряхивалось от вермикулита и в стерильных условиях переносилось на агаризованную среду, которая в свою очередь выдерживалась в термостате. Выросшие на агаризованной среде колонии микроорганизмов фотографировали и в дальнейшем микроскопировали препараты, приготовленные из образцов с чашек Петри. Каждая последующая установка останавливалась через определенное время и с проросшим семенем огурца проводили аналогичные манипуляции.

На первом этапе исследований в установке было проведено проращивание семян огурца сорта Атлет в стерильных условиях. Это было необходимо для определения возможности работы установки и проращивания в ней семян и возможности проведения процесса в контролируемых стерильных условиях. Одновременно, часть семян проращивали во влажной камере по стандартной методике [4] Проведение эксперимента по описанной выше методике показало, что семена прорастают в установке аналогично тому, как они прорастают во влажной камере. Но, при этом корневаясистема располагается в объеме вермикулита не хаотично, а ориентировано к низу. Время от момента набуханиядо фазы развернутых семядолей (период мезотрофного проростка) в наших экспериментах составил ориентировочно 5 суток. Кроме того, было подтверждено, что система, используемая для исследований, позволяет в ходе эксперимента 5 и более сутокподдерживать процесс в стерильных условиях.

Следующим этапом исследований было изучение колонизации корневой системы огурца и семядолей клетками Pseudomonas fluorescens. Выращивание семян огурца Атлет, обработанных клеткамиPseudomonas fluorescens, проводили по аналогичной схеме. После извлечения проростка из системы культивирования он помещался на агаризованную среду Кинга и переносился в термостат.

На фото1 приведены характерные результаты выросших через сутки колоний микроорганизмов.

Как видно на фото 1 , характерные, однородные колонии расположены равномерно по всей длине корневой системы проростка огурца. Последующее микрокопирование колоний при помощи фиксированных окрашенных препаратов подтвердило, что по всей длине корневой системы были обнаружены исходные клетки Pseudomonas fluorescens . Аналогичные результаты были получены для всех образцов семян, извлеченных из установки с интервалом в одни сутки. Таким образом можно говорить о том, что клетки Pseudomonas fluorescens , нанесенные на семя огурца, при его прорастании растут вместе с корневой системой, по всей видимости покрывая ее. Вторым не менее интересным результатом является то, что ни на проростке, ни на семядолях во всех образцах мы не обнаружили никаких клеток, в том числе и клеток Pseudomonas fluorescens .

Полученные результаты показывают, что клетки Pseudomonas fluorescens эффективно колонизируют корневую систему огурца сорта Атлет и растут вместе с ростом корневой системы. Это может происходить только за счет выделений, образующихся при прорастании семян, скорее всего на этой стадии преобладают сахара, ди- и трикарбоновые кислоты, аминокислоты. А вот полное отсутствие микроорганизмов на стебле и семядолях проростка огурца свидетельствует о том, что их развитие не только невозможно в виду отсутствия экссудатов, которые в данной части растения не выделяются, но и скорее всего их развитие ингибируется продуктами метаболизма растения. Что это за вещества (фитоалексины или иные органические соединения или комплекс литических ферментов) пока не ясно, но ясно, что при обработке семян по принятой нами методике часть микроорганизмов просто неизбежно должна была контактировать с семядолями растения. Безусловно данные результаты требуют еще осмысления и проведение дальнейших исследований.

Бактерии Pseudomonas fluorescens обладают фунгицидными свойствами и соответственно необходимо было исследовать, как проявляются эти свойства у клеток, выросших на поверхности корневой системы проростков огурца.

Для этого были проведены эксперименты, в которых семена огурца обрабатывались суспензией клеток Pseudomonas fluorescens , помещались в систему выращивания, а далее, через сутки после того, как семена начинали прорастать, в систему стерильно вносили суспензию спор Fusarium oxysporum . Этим мы моделировали появление фитопатогенного микроорганизма рядом с прорастающим семенем.

В качестве контроля был взят образец семян, не обработанный суспензией клеток Pseudomonas fluorescens . Как и в предыдущем эксперименте, через каждые сутки одно из растений изымали из установки для определения колонизации корневой системы высевом на агаризованную среду. Контрольный вариант анализировали в конце эксперимента. Все остальные параметры эксперимента (температура, режим полива) оставались прежними.

На фото 2 показан отпечаток корневой системы огурца, на семена которого были нанесены клетки Pseudomonas fluorescens , а затем после суток проращивания клетки Fusarium oxysporum . Как видно на фотографии вдоль корневой системы проростка практически нет колоний Fusarium oxysporum , зато вся корневая система покрыта колониями Pseudomonas fluorescens . В контрольном варианте вся корневая система проростка огурца покрыта Fusarium oxysporum (фото 3).

Таким образом из эксперимента видно, что предварительная обработка семян огурца сорта Атлет F1 клетками Pseudomonas fluorescens обеспечивает равномерное распределение клеток по корневой системе проростка несмотря на то, что их рост происходит против градиента кислорода. Это обусловлено тем, что вдоль прорастающей корневой системы находится зона с максимальной концентрацией экссудатов.

Отсутствие заражения корневой системы Fusarium oxysporum в варианте предварительной обработки семян клетками Pseudomonas fluorescens скорей всего объясняется совокупностью свойств клеток Pseudomona sfluorescens :

• высокой скоростью метаболизма экссудатов корневой системы огурца, очень низкой остаточной концентрацией экссудатов;
• колонизацией вдоль растущей корневой системы проростка и скорее всего образованием многослойной микробной пленки;
• стимулирование роста корневой системы за счет образования активных для растения биологических соединений;
• достаточно высокой фунгицидной активностью против грибов рода Fusarium.

1. Метлицкий Л.В. Как растения защищаются от болезней. – Наука, 2013.

2. Нетрусов А.И., Егорова М.А., Захарчук Л.М. Практикум по микробиологии: Учеб. пособие/Под ред. А.И.Нетрусова. – 2005.

3. Hoagland D. R. et al. The water-culture method for growing plants without soil //Circular. California agricultural experimentstation. – 1950. – Т. 347. –2nd edit.

4. ГОСТ 12038-84. Семена сельскохозяйственных культур. Методы определения всхожести (с Изменениями № 1, 2)

5. Горюнова О.Б., Марквичев Н.С. Профилактическая защита рассады от болезней с умом. Как? // Биом. – 2017. –№1. –Москва

https://www.biom-group.ru/blog/kolonizatsiya-kornevoy-sistemy-ogurtsa-bakteriyami-pseudomonas-fluorescens/
https://www.biom-group.ru/blog/kolonizatsiya-kornevoy-sistemy-ogurtsa-bakteriyami-pseudomonas-fluorescens/