ДНК-технологии — современный способ диагностики болезней растений Текст научной статьи по специальности « Сельское хозяйство, лесное хозяйство, рыбное хозяйство»

CC BY

Аннотация научной статьи по сельскому хозяйству, лесному хозяйству, рыбному хозяйству, автор научной работы — Баранов Олег

В лаборатории генетики и биотехнологии Института леса НАН Беларуси разработаны методы ранней диагностики грибных заболеваний основных древесных видов республики, создается генетический атлас-определитель и коллекция ДНК-патогенов. В регулярно пополняемом перечне основных возбудителей более 80 микроорганизмов.

Похожие темы научных работ по сельскому хозяйству, лесному хозяйству, рыбному хозяйству , автор научной работы — Баранов Олег

DNA technology is a modern method of diagnostics of plant diseases

In the laboratory of genetics and biotechnology, Institute of forest of NAS of Belarus developed methods of early diagnostics of fungal diseases of major tree species of the Republic, created a genetic Atlas of the determinant and the collection of DNA pathogens. To regularly update the list of the major pathogens, more than 80 microorganisms.

Текст научной работы на тему «ДНК-технологии — современный способ диагностики болезней растений»

ведущий научный сотрудник лаборатории генетики и биотехнологии Института леса НАН Беларуси, кандидат биологических наук

ДНК-технологии — современный способ диагностики болезней растений

В лаборатории генетики и биотехнологии Института леса НАН Беларуси разработаны методы ранней диагностики грибных заболеваний основных древесных видов республики, создается генетический атлас-определитель и коллекция ДНК-патогенов. В регулярно пополняемом перечне основных возбудителей — более 80 микроорганизмов.

Болезни — неотъемлемая часть существования любых живых организмов. Патологическое состояние растений вызывает снижение их продуктивности, устойчивости, структурные и физиологические аномалии. По характеру все болезни можно разделить на неинфекционные и инфекционные. Особый вред лесному хозяйству наносят инфекционные заболевания. Среди возбудителей последних превалируют грибные инфекции — около 97%, на долю бактериальных приходится 2%, вирусных — 1%.

Как и в медицине, болезнь определяется по вызвавшим ее причинам, возбудителю и признакам поражения или ослабления растения. Для этого применяют различные методы: морфологические — по внешним признакам поражения, микроскопические — выявление клеток болезнетворных организмов в тканях растения,

биохимические — с использованием специальных красителей и тест-систем, молекулярно-генетические — с помощью современных методов анализа ДНК.

Диагностировать болезнь по внешнему виду возможно только при наличии явных ее признаков: гнилей, пятнистости листьев, опухолей, почернения (некрозов) и др., то есть на поздних стадиях. При этом точно определить возбудителя практически невозможно, поскольку одни и те же симптомы могут быть вызваны как различными видами патогенных организмов, так и неблагоприятными внешними условиями. Например, увядание листьев может являться следствием недостатка влаги в почве, высоких температур, повреждения корней или поражения сосудистой системы грибами-паразитами.

Поскольку большинство возбудителей — это микроорганизмы (микроскопические грибы, бактерии), выявить их без специального оборудования практически невозможно. Для этого используют в основном микроскопический метод. Из-за того что достоверный анализ пораженных растительных тканей или почвенных образцов затруднен вследствие наличия чужеродных примесей и структур, деградации клеток или мицелия патогенов, для

микроскопических исследований пригодны лишь чистые культуры возбудителей заболеваний. Они создаются путем переноса клеток патогенного организма в емкости с искусственной питательной средой с последующим их выращиванием в лабораторных условиях. Следует отметить, что создание чистых культур —достаточно длительный и трудоемкий процесс. Диагностировать болезни растений также позволяют и химические экспресс-тесты. Но получить результат можно только при высоком уровне зараженности тканей патогеном. Большие успехи в области выявления возбудителей заболеваний растений достигнуты за счет применения иммуноферментных методов. Однако сложность получения антител для каждого нового патогена создает ограничения для широкомасштабного внедрения данной технологии в лесном хозяйстве.

Наиболее эффективны и перспективны в области изучения патогенных микроорганизмов методы, основанные на использовании ДНК-анализа. ДНК-маркеры прошли длительную апробацию в различных областях медицины — для выявления и профилактики инфекционных, врожденных и онкологических заболеваний. Их преимущества очевидны — ранняя и

НАУКА И ИННОВАЦИИ №3(97)_2011

точная диагностика болезней, быстрота выполнения анализов, ограниченное влияние человеческого фактора.

Неповторимость структуры ДНК разных видов является методологической основой выявления и идентификации различных патогенов. Еще на одном уникальном свойстве молекулы ДНК — явлении ком-плементарности — построено большинство существующих ДНК-технологий. В обычном состоянии молекула ДНК состоит из двух параллельных цепей, каждая из которых—своеобразное «зеркальное» отражение другой. Если разъединить их, то каждая из одиночных нитей будет пытаться восстановить первоначальную двухцепочечную структуру, «отыскивая» комплементарную нить. По данному принципу в ходе исследования специальные ДНК-зонды отыскивают молекулы ДНК-патогенного организма и связываются с ними, отделяя их от других молекул ДНК, в том числе растения-хозяина.

Выделить ДНК можно из любой части растения (как живого, так и мертвого), воды, почвы и др. Для анализа достаточно всего нескольких миллиграммов растительных тканей и нескольких граммов воды и почвы. Современные методы, к примеру ПЦР-анализ, способны диагностировать болезнь, даже если в образце присутствует лишь одна живая клетка патогена.

Интерпретация данных, полученных путем анализа, является процедурой сравнительно несложной и сводится к визуальной оценке наличия или отсутствия ДНК-патогена в образце. Существуют также и компьютерные программы, позволяющие автоматизировать процесс. Количественное содержание возбудителей в образце ткани или пробы воды, почвы устанавливается с помощью одного из разновидностей ДНК-анализа — ПЦР в реальном времени. Данный метод применяется также и для определения степени устойчивости растений. В ходе исследования различных инфицированных клонов растений сравнивается степень содержания в тканях чужеродной ДНК патогена по отношению к собственной ДНК растения. Чем ниже это соотношение, тем клон более устойчив.

За последнее десятилетие расшифрована структура ДНК большинства хозяйственно значимых фитопатогенов. Информация о них находится в открытом или платном доступе на интернет-сайтах генных банков и постоянно пополняется. Имеющиеся нуклеотидные последовательности позволяют разработать специальные ДНК-зонды для выявления практически любого вида возбудителя. Если же он новый или данные о нем отсутствуют, то с помощью специального прибора — секвенатора — можно провести расшифровку его ДНК.

ДНК-анализ позволяет выявлять и идентифицировать фитопатогены в лесных насаждениях различного типа вне зависимости от их происхождения, возраста и условий произрастания. Существенно то, что выявлять болезни можно на самых ранних стадиях.

Современные молекулярно-генетические технологии незаменимы в лесных питомниках и теплицах: ДНК-маркеры можно использовать как для оценки степени зараженности выращиваемого посадочного материала, так и в ходе проведения профилактических мероприятий — для анализа потенциальных источников инфекции — почвы и используемой для полива воды.

Следует отметить, что результаты исследований, проведенных в нашем институте, уже внедрены в девяти белорусских лесхозах, двенадцати учреждениях различной ведомственной подчиненности. В настоящее время прорабатывается вопрос о заключении договора с российским Центром защиты леса на оказание услуг в области создания аналогичной лаборатории и продажи ряда разработанных технологий. Так-

же в 2011 г. на базе Института леса планируется создать Фитопатологический центр лесных древесных видов. Финансировать проект предполагается за счет инновационных фондов Министерства лесного хозяйства и Национальной академии наук Беларуси. Фитопатологический центр станет объектом, сочетающим в себе научную направленность в области разработки и опробации современных технологий и получения новых знаний и практическую, выраженную в организации мероприятий по фитопатологическому обследованию лесных насаждений и питомников с помощью современных молекулярно-генетических и биотехнологических методов. Кроме ранней диагностики и профилактики заболеваний, центр займется разработкой мер по ликвидации или снижению численности патогенов, минимизации ущерба, нанесенного болезнетворными микроорганизмами, будет создана коллекция чистых культур и ДНК-фитопатогенных видов грибов и бактерий Беларуси.

Внедрение системы ранней диагностики возбудителей инфекционных заболеваний в лесных питомниках позволяет увеличить выход и качество посадочного материала. Даже при условии повышения данного показателя на 10—15% и средней стоимости одного (неселекционного) саженца лесных древесных видов 35—45 руб. при ежегодном объеме выращивания 150—250 млн экземпляров ожидаемый экономический эффект от внедрения технологий только в лесохозяйственную практику составит более 1 млрд руб. в год. В случае использования селекционного посадочного материала лесных древесных видов эта цифра вырастет в 1,5—2 раза.

Основные методы мониторинга болезней пшеницы. Часть 4

Интегрированная защита растений состоит из 4 блоков: мониторинг за вредными организмами, анализ информации, установочные и корректирующие мероприятия. При этом мониторинг должен обеспечивать регулярный сбор информации об абиотических элементах среды и популяциях вредных организмов (Гулий, Миняйло, 1989).

Продолжение. Начало читайте:

Для составления краткосрочного прогноза и своевременного проведения химической защиты посевов необходимо постоянно следить за распространением и динамикой развития болезней, особенно за ржавчиной, септориозом, пиренефорозом и другими. Для этого выбирают 2-3 типичных стационарных участка или поле и по основным фазам развития растений проводят наблюдения: в благоприятные для заражения растений и развития болезней погодные условия еженедельно или один раз за декаду. Общий мониторинг фитосанитарного состояния проводится в период массового распространения болезней, охватываются им посевы, размещенные по разным предшественникам, посеянные в разные сроки, сортовое разнообразие культур [рис. 39].

Глазомерную балловую оценку интенсивности развития болезней обычно проводят по следующей шкале:

0 балла – растения здоровые;

1 балл – слабое поражение органа или растения;

2 балла – умеренное поражение, сильно пораженных органов или растений нет;

3 балла – среднее поражение, у некоторых органов или растений – сильное;

4 балла – сильное поражение органов и гибель растений.

При равномерном распространении заболевания учет болезней можно проводить с любой стороны поле, отступив от края 25-50 м, заходя вглубь посева до 100-200 м, анализируется определенное количество растений или отбирают пробы стеблей или листьев по треугольнику или произвольно из 7-10 площадок, при неравномерном (очажном) – по диагонали поле.

Рисунок 39. Мониторинг болезней пшеницы в зависимости от фазы развития и химические мероприятия проводимые для защиты её посевов

При учете болезней устанавливают 2 показателя: распространение, или количество пораженных растений в посевах, интенсивность или степень развития.

Распространение болезней (Р) определяют по формуле:

Р = n × 100 / N,

где: N – общее количество растений в пробах;
n – количество больных растений.

Средневзвешенный процент распространения (Р0) болезни вычисляют по формуле:

где: ∑SP – сумма произведений площади полей на соответствующий процент распространения болезни;
S – обследованная площадь, га.

Интенсивность развития болезней (R) в процентах или баллах определяют по формуле:

где: ∑ab – сумма произведений пораженных растений на соответствующий им балл или процент поражения;
N – общее количество учетных растений в пробах;K – наивысший балл шкалы.

Для получения более точных результатов используются специальные шкалы, характеризующие интенсивность развития той или иной болезни. Ниже приводятся методы учета основных групп болезней пшеницы.

Мониторинг болезней с воздушно-капельной инфекцией
Виды ржавчины

Для своевременной обработки посевов фунгицидами с целью предотвращения больших потерь урожая зерна от ржавчины и других болезней с аэрогенной инфекцией нужно постоянно следить за их появлением и распространением. В районах, где возделывают озимую пшеницу и рожь, учет ржавчины проводят с осени при появлении 2-3 листьев. Весной после их отрастания (апрель-май) на 10 площадках поле анализируют не менее 100-200 растений (листьев) и определяют распространение ржавчины и степень ее развития. По основным фазам развития яровой пшеницы ведут регулярные учеты и устанавливают сроки заражения посевов, распространение видов ржавчины, септориоза и других. При обнаружении признаков болезни через каждые 25-50 шагов берут 5-10 проб по 10-15 растений или стеблей. В лаборатории проводят детальный анализ, учитывая количество больных растений, степень поражения листьев или стеблей отдельно для каждой болезни. Интенсивность или степень развития ржавчины определяют в процентах по шкалам: бурой – Русакова, желтой – по Маннерсу, стеблевой по видоизмененной Коббом-Петерсона [рис. 40 и 41] и результаты заносят в полевой журнал или компьютерную программу.

В зависимости от приуроченности возбудителей болезней к определенным органам в течение онтогенеза растений анализируются листья различного яруса, междоузлия стеблей и колос. Если учет проводится в период трубкования-колошения, то анализируются 2 листа нижнего и среднего яруса, в период налива зерна – верхние 2 листа, включая флаговый. Последний учет бурой и желтой ржавчины проводят в фазу молочно-восковой спелости, стеблевой – в период восковой или полной спелости зерна [табл. 90].

Наблюдения за урединиоспорами ржавчины в приземном слое воздуха, атмосфере и осадках. Для определения сроков заражения растений видами ржавчины нужно вести постоянный мониторинг за содержанием их спор в воздухе и выпадаемых осадках. Наиболее аспространенным и доступным методом анализа заноса спор воздушным потоком является улавливание их флюгерным приспособлением [рис. 42] или спороловушками типа ПЛС-71 и ПЛС-71М. Оно проводится в период возможного развития ржавчины на пшенице: от фазы кущения до начала налива зерна. Приборы устанавливают среди посевов, предметные стекла, смазанные вазелином или касторовым маслом, следует менять через 2-3 дня. На наклейку записывают название или географические координаты наблюдательного пункта, число и месяц. Анализируются в лаборатории при слабом увеличении микроскопа (8 × 20 или 10 × 20). При отсутствии спор или небольшом их количестве просматривается вся поверхность предметного стекла, при наличии 1-2 спор – 2/3; 3-4 спор – 1/2, 5-10 – 1/3; более 10 спор – 1/5 его поверхности. Определяется вид ржавчины, число спор учитывается в 10 полях зрения микроскопа, как при определении заспоренности семян телиоспорами твердой головни.

Рисунок 40. Шкалы для оценки степени пораженности листьев пшеницы ржавчиной: (а) Русакова – бурой ржавчины, (б) Маннерса – желтой ржавчины

Рисунок 41. Модифицированная Коббом шкала Петерсона (Peterson et all. 1965) для оценки степени пораженности листовой и стеблевой ржавчиной

Таблица 89. Основные органы для учета болезней пшеницы с воздушно-капельной инфекцией

Для получения данных о наличии спор ржавчины, оседающих с осадками, проводят анализ дождевой воды. Для этой цели применяют прибор, состоящий из воронки диаметром от 15 до 24 см, со стеклянной трубкой длиной 20-30 см и диаметром 44 мм. В нижней её части устанавливают микрофильтр, который пропускает воду, но задерживает споры грибов [рис. 43]. После каждого дождя анализируется содержание спор ржавчины и других патогенов на фильтре путем центрифугирования и микроскопирования осадков.

Количество урединиоспор на 1 м 2 площади рассчитывают по формуле:

где: N – количество спор на 1 м 2 , шт;
n – количество спор на всей поверхности фильтра, шт;
S – площадь верхней горизонтальной части воронки, см 2 .

Если в период стеблевания пшеницы в течение суток в воздухе и осадках улавливаются две и более спор ржавчины на 1 см2 и условия для заражения растений благоприятные, то следует ожидать массовую вспышку болезней через 7-10 суток. Возникновение эпифитотий ржавчины возможно при обнаружении 10-15 спор на 10 см2 в период колошения пшеницы.

Рисунок 42. Флюгер для улавливания спор ржавчины в воздухе Рисунок 43. Прибор для учета спор ржавчины в дождевой воде

Со дня обнаружения урединиоспор гриба в приземном слое воздуха необходимо постоянно следить за относительной влажностью, среднесуточной температурой и появлением первых урединий гриба на листьях и стеблях. Важное значения для заражения растений имеет наличие росы. Заражение пшеницы бурой ржавчиной при средней температуре от 10 до 15°С происходит при продолжительности росяного периода более 5 часов, от 16 до 20°С сокращается до 4 часа.

Скорость развития возбудителей ржавчины зависит от температуры воздуха. Время, необходимое для одной генерации гриба, можно определить по формуле:

где: n – продолжительность генерации, сутки;
С – сумма эффективных температур для развития одной генерации, °С;
Т – среднесуточная температура воздуха, °С;
t – нижний температурный порог развития грибов.

Сумма эффективных температур, т.е. среднесуточных, превышающих нижний порог развития возбудителя бурой ржавчины, составляет 85°С, стеблевой – 125, желтой – 171, нижние пороги – 1,9, –2 и –0,7°С соответственно (методические указания, 1981; 1982). Пользуясь специальными номограммами или моделями можно прогнозировать интенсивность поражения посевов пшеницы видами ржавчины к молочно-восковой спелости зерна и возможные потери урожая зерна, определить необходимость химической защиты посевов от болезни и оптимальные сроки ее проведения.

Идентификация урединиоспор возбудителей ржавчины. У стеблевой ржавчины они имеют эллипсоидальную форму и четкий контур из-за окрашенной оболочки, бурой и желтой ржавчины -шаровидные или округло-овальные, примерно одинакового размера. Оболочка урединиоспор желтой ржавчины бесцветная, 1-2 мкм толщины, покрыта очень мелкими шипиками и 10-12 ростковыми порами; у бурой ржавчины 1-2 мкм толщины, густо покрыты маленькими шипиками, с 8-10 ростковыми порами.

Пятнистости листьев, мучнистая роса

Распространение и степень развития видов септориоза, желтой пятнистости или пиренефороза учитывают одновременно с ржавчиной. Для определения степени пораженности листьев можно использовать унифицированную шкалу Джеймса показателями: 1, 5, 10, 25, 50 и 100% [рис. 44а], колосьев – 5, 10, 25 и 50% [рис. 44б].

В регионах, где возделывают озимую пшеницу, наблюдения за мучнистой росой проводят осенью, продолжают весной следующего года, на яровой пшенице – от стеблевания до колошения. Степень пораженности листьев и других органов определяют по видоизмененной шкале Э.Э. Гешеле [рис. 45].

Виды головни, корневые гнили и другие болезни

Виды головни учитывают в период восковой или полной спелости зерна при апробации посевов. Для этого по диагонали поля через равные расстояния (50-100 метров) проверяют на корню или отбирают для детального анализа 1000 стеблей (по 25-50 с каждой площадки), пыльную легко определить во время цветения пшеницы. При анализе апробационного снопа учитывают все виды головни.

Рисунок 44. Шкалы для оценки пораженности листьев (а) и колоса (б) пшеницы грибными пятнистостями

Рисунок 45. Шкалы СИММИТ для оценки реакции и степени пораженности пшеницы видами ржавчины

Корневые гнили. Учет пораженности пшеницы болезнью проводят в фазу 2-3 листьев и перед уборкой урожая: через каждые 25-50 метров берут 10 проб, вырывая с корнем 10-20 растений с каждой площадки. В лаборатории их анализируют, пораженность всходов определяют в баллах по шкале ВИЗР:

0 балла – признаки болезни отсутствуют;
0,1 балла –единичные штрихи на колеоптиле;
1 балл – слабое побурение колеоптиле;
2 балла – умеренное побурение колеоптиле;
3 балла – сильное побурение, проникающее под колеоптиле;
4 балла –погибший проросток.

В фазу восковой или полной спелости зерна проводят второй учет, пробы отбирают аналогично, как в фазу всходов, или можно использовать апробационные снопы. В лаборатории основание корня очищается от листьев, определяется степень развития болезни по 4-х балльной шкале [рис. 46].

0 балла – здоровые растения;
0-1 балл – у основания стебля или у его подземной части бурые штрихи или полосы, занимают до 1/5 части пораженного органа;
2 балла – коричневые полосы или пятна, охватывающие от 25 до 50% поверхности пораженного органа;
3 балла –сильное побурение первого стеблевого и подземного междоузлия;
3-4 балла – отсутствие продуктивных стеблей при наличии симптомов по баллу 3.

3-4 – При отборе проб растений на корневую гниль в 10 точках берут почву весом 1-2 кг, инфицированность её возбудителем болезни определяют по методике Ледингама и Чина (1955). Просеивают её через сито диаметром 1 мм, взвешивают 10 г и помещают в пробирку 20×200 мм, приливают 5 мл веретенного или другого минерального масла, 30 мл водопроводной воды. Закрытую резиновой пробкой пробирку помещают в горизонтальном положении на ротатор и взбалтывают с постоянной частотой в течение 10-15 мин. После отстаивания пробирки в течение 1-1,5 ч, капли эмульсии объемом 0,01 мм просматривают на предметном стекле под бинокуляром или микроскопом при увеличении 40-80 × в 10-кратной повторности. Соответствующим пересчетом определяют количество конидий в 1 г почвы.

Рисунок 46. Шкала для оценки степени пораженности нижнего междоузлия пшеницы корневой гнилью

Вирусные и бактериальные болезни. В период колошения – молочной спелости зерна по диагонали поля на 10 площадках подсчитывают общее количество растений на 1 погонном метре и пораженных вирусными болезнями. Степень их проявления определяют по шкале Г.М. Развязкиной:

0 балла – здоровые растения;
1 балл – слабое поражение, листья с симптомами мозаики;
2 балла – среднее поражение, на листьях признаки мозаики;
3 балла – сильное поражение, листья ярко мозаичные, растения карликовые;
4 балла – погибшие растения.

Распространению бактериальных болезней пшеницы определяют при мониторинге листовой ржавчины и септориоза. Для оценки степени их развития на листьях и колосковых пленках можно использовать шкалы, рекомендованные для учета пятнистостей.

Методы фитоэкспертизы семян, экономические пороги их зараженности

Как известно, семена являются источником и участвуют в передаче инфекций многих болезней растений. Основными патогенами пшеницы, передающимися семенами, являются возбудители пыльной, твердой и карликовой головни, септориоза, гельминтоспориозной (Bipolaris sorokiniana) и фузариозной (виды Fusarium) корневых гнилей и бактериоза. Кроме того, в период формирования, уборки и хранения семена заселяются многочисленными эпифитными и сапрофитными грибами, в т.ч.: Alternaria, Cladosporium Trichotecium и др., а также плесневыми – виды Penicillium, Aspergillus, Mucor. Последние интенсивно развиваются при высокой влажности семян (15-16%) и снижают полевую их всхожесть. Возбудители «черного зародыша» пшеницы грибы A. tenuies и A. alternatа. Первый вид существенно не влияет на посевные качества семян и технологические свойства муки в связи с его локализацией в плодовой оболочке, а второй проникает глубже, поражая зародыш и снижает всхожесть.

В связи с изложенным необходимо определение зараженности семян инфекционными зачатками возбудителей болезней. Они присутствуют в виде примесей к семенам: телиоспор головни, конидий грибов, клеток и спор бактерий. Наиболее распространенными методами фитоэкспертизы семян являются визуальный, центрифугирование, биологический, бактериологический и анатомический анализы. В отдельных случаях применяют серологический и люминесцентный методы (Наумова, 1970; Кривченко с соавт., 1971).

Контрольный анализ семян пшеницы на грибную и бактериальную инфекцию проводят районные и областные инспекции Министерства сельского хозяйства, при необходимости лаборатории научно-исследовательских институтов и опытных станций.

Визуальный осмотр проводится одновременно с анализом чистоты семенного материала. При этом устанавливают наличие в зерне примесей головневых мешочков и рожков спорыньи. Семена рассыпают на стекло тонким слоем и делят линейкой на 4 треугольника, из каждого отбирают по 100 зерен и по шкале А.Г. Тороповой определяют степень пораженности их «черным зародышем»:

0 балла – здоровые семена;
0,5 балла –следы окрашивания зародыша размером с точку;
1 балла – потемнение зародыша и окружающей ткани;
2 балла – потемнение охватывает за пределами зародыша до ½ поверхности зерна;
3 балла – то же более ½ поверхности зерна.

Рисунок 47. Схема фитоэкспертизы семян пшеницы на зараженность грибной и бактериальной инфекцией

Для анализа зараженности семян комплексом патогенов проводятся дополнительные анализы методами: на заспоренность твердой головней – центрифугирование, пыльной головней – гистологический, инфицированность септориозом и гельминтоспориозом – биологическим.

Путем обмывки и центрифугирование устанавливают заспоренность семян пшеницы телиоспорами наружных видов головни, а также конидиями грибов Helminthosporium, Fusarium, Alternaria, Septoria. Для этой цели из среднего образца отбирают 2 пробы по 100 зерен, их помещают в чистые пробирки, заливают 10 мл воды и взбалтывают. После этого воду сливают в специальные пробирки и центрифугируют в течение 5 минут при оборотах 1 000-1 500. Из пробирки сливают воду, осадок взмучивают, наносят каплю его на предметное стекло и просматривают под микроскопом в 10 поле зрения. Данные суммируют и определяют среднее количество спор головни для каждой пробы по формуле:

где: Х – число спор на 1 зерно;
А – среднее число спор на 1 поле зрения микроскопа;
К – постоянный коэффициент: произведение числа полей микроскопа, размещающихся на покровном стекле, умноженное на число капель в 0,5 мл.

Площадь поля зрения микроскопа определяют по формуле:

где: π – постоянное число, равное 3,14;
R – диаметр поле зрения микроскопа.

Диаметр поля зрения микроскопа измеряют посредством объективного микрометра при определенном увеличении, затем подсчитывают число делений в одном, которое умножают на величину деления.

Биологический метод. Из исходного образца семя отбирают по 50 зерен и анализируют их во влажной камере. Для этого на стерильное дно чашки Петри кладут 2-3 слоя фильтровальной бумаги или кружочки марли, увлажняют их стерильной водой. Для выявления внутренней инфекции семена предварительно дезинфицируют в 0,5% растворе перманганата калия (KMnO4) в течение 5 минут или 0,1% растворе формалина, затем промывают стерильной водой. Чашки Петри с высеянными семенами инкубируют в термостате при 20-25°С течение 5-7 суток. Затем их анализируют визуально или при слабом увеличении микроскопа.

Рисунок 48. Фитоэкспертиза семян пшеницы в стерильном песке (а) и на фильтровальной бумаге (б) для определения зараженности грибной инфекцией

Для анализа зараженности семян пшеницы гельминтоспориозной, альтернариозной и фузариозной инфекциями проращивают по 20-25 зерен в 4-5 – кратной повторности при температуре 25°С в чашках Петри на увлажненном песке или фильтровальной бумаге. На 7-е сутки просматривают их визуально, при наличии спороношения грибов при слабом увеличении микроскопа по морфологии конидии определяют видовой их состав.

Возбудители многих грибных и бактериальных болезней хорошо растут на искусственных питательных средах. Поэтому, для определения инфицированности семян и грибной или бактериальной инфекцией, идентификации возбудителей наряду с влажной камерой могут быть использованы синтетическая среда Чапека и картофельный агар.

Рисунок 49. Проращивание семян на бумажных рулонах для установления пораженности их грибной и бактериальной инфекцией

Рисунок 50. Колонии грибов Bipolaris sorokiniana (а), A. tenuies (б), Fusarium spp (в) на искусственной питательной среде

Гистологический метод применяется для определения зараженности семян пшеницы пыльной головней. Кипятят их в колбе в 3%-ном растворе КОН или NaOH (из расчета 100-150 мл раствора на (100-120 зерен), на ситах размером 5, 3 и 1 мм зародыши отделяют от эндосперма и тщательно промывают водопроводной водой. В течение 2-4 минут окрашивают их в 1%-ном растворе анилинового синего, приготовленного в 40-45% уксусной кислоте, затем зародыши промывают в молочной кислоте для удаления лишней краски. В этом растворе их можно оставить на 2-3 дня (Кривченко, 1985).

Серологический метод применяется для диагностики бактериальных болезней пшеницы. Капельный метод, разработанный М.С. Дуниным и Н.Н. Поповой, позволяет идентифицировать возбудителей черного и базального бактериоза пшеницы. Для этого на предметном стекле смешивают специальную сыворотку с чистой культурой бактерий. При положительной реакции выпадает осадок, заметный невооруженным глазом.

Люминесцентный анализ. Семена пшеницы раскладывают в один ряд на черной бумаге, затем их на расстоянии от 15 до 30 см помещают под ртутно-кварцевую лампу. При этом здоровые семена дают сине-голубую или сине-фиолетовую флуоресценцию, а зараженные пыльной головней – не флуоресцируют, имеют тусклый вид. При поражении семян грибами из родов гельминтоспориум, фузариум и патогенными бактериями наблюдается аналогичная реакция.

На основе анализа результатов многолетних экспериментальных исследований и обобщения литературных данных разработаны предельно допустимые показатели пораженности колосьев головней, инфицированности семян и зараженности почвы возбудителем коревой гнили [табл. 91].

При зараженности семян выше указанных показателей рекомендуется обязательное их протравливание. Минимальные индексы инфицированности берутся при возделывании восприимчивых сортов или неблагоприятной фитосанитарной ситуации, а максимальные – для сравнительно устойчивых сортов и при благоприятных для роста и развития растений погодных условий.

Таблица 91. Критические параметры инфицированности семян и почвы возбудителями болезней

https://cyberleninka.ru/article/n/dnk-tehnologii-sovremennyy-sposob-diagnostiki-bolezney-rasteniy
https://agrovesti.net/lib/tech/growing-cereals/osnovnye-metody-monitoringa-boleznej-pshenitsy-chast-4.html