ПЦР-диагностика
Полимеразно-цепная реакция (ПЦР) – это одно из самых ярких достижений в сфере молекулярной биологии. Метод получил широчайшее распространение в разных областях науки. Благодаря очень высокой специфичности и чувствительности, метод ПЦР применяется в медицине, биологии, ветеринарии, криминалистике, санитарной службе и других отраслях деятельности человека.
Для анализа методом ПЦР можно использовать любые биологические материалы, которые содержат нуклеиновые кислоты (молекулу ДНК или РНК).
Принцип ПЦР- исследования
У каждого живого существа, по крайней мере, на нашей планете, есть уникальный «отпечаток» — ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота), которая отвечает за передачу наследственных факторов от предков к потомкам. Структурно эта молекула представляет собой две нити из молекул-азотитых оснований, удерживаемые рядом друг с другом химическими связями и скрученные в спираль (считается, что для компактности). Из курса биологии вы можете помнить такие названия, как аденин (А), гуанин (Г), тимидин (Т) и цитозин (ц). Это 4 нуклеотида, которые и создают последовательность ДНК. Вирусы хранят свою генетическую информацию в другой нуклеиновой кислоте – РНК.
Информация об уже изученных ДНК и РНК хранится в научных базах лабораторий. После того, как был изобретен метод ПЦР, для многих возбудителей различных заболеваний (бактерии, грибки и вирусы) были созданы свои специфические генетические детекторы (праймеры) — уникальные последовательности нуклеотидов, характерных только для конкретного возбудителя. И если поместить их в пробирку с исследуемым материалом, при наличии в нем ДНК или РНК «живых» возбудителей, праймеры запускают реакцию репликации – создания огромного числа копий, которое можно идентифицировать визуально. Т.е. они начинают копировать свою ДНК/РНК десятки раз.
И при подсчете результатов сотрудники лаборатории могут понять, есть ли искомые бактерии и вирусы в исследуемом образце, или нет, именно поэтому результаты ПЦР чаще всего качественные, т.е. «обнаружено» или «не обнаружено».
Кому мы обязаны появлением метода ПЦР?
Со слов американского биохимика Керри Мюллиса (Kary Mullis), идея идентифицировать живые организмы по короткому участку их генетического кода (ДНК) пришла ему в голову в 1983 году, по пути с работы домой. А в основе этой идеи, лежала работа другого американского биохимика, Артура Корнберга (Arthur Kornberg), которая в свое время не нашла отклика у научного сообщества.
Керри допустил возможность того, чтобы взять молекулу ДНК какого-либо организма, с помощью высокой температуры «распустить» ее спираль на две нити, специфическими маркерами-праймеры пометить уникальные для этого микроорганизма участки ДНК и затем, применив фермент ДНК-полимеразу, создать из двух нитей две новые молекулы ДНК. Но уже содержащие в себе меченные праймеры. И потом останется просто искать эти участки в диагностическом материале.
В итоге, корпорация CETUS, в которой работал Мюлис, выделила ему команду ученых. И в 1985 году, в издании Американского общества генетики человека, появилась публикация с теоретическим обоснованием ПЦР, как метода идентификации генетического материала живых организмов.
Как это все происходит в лаборатории
Выделение ДНК
Сначала пробу биологического материала подготавливают: центрифугируют, осаждают и т.д. Затем лаборантам необходимо выделить ДНК из полученного биологического концентрата.
Амплификация (увеличение числа копий ДНК)
Важнейший этап исследования. Проводится в термоциклере и именно здесь проходят все процессы, подпадающие под определение полимеразно-цепная реакция: денатурация, отжиг, элонгация.
Денатурация
Самый первый этап – развернуть (денатурировать) нуклеиновые кислоты, чтоб сделать их доступными для дальнейшей работы. Осуществляется путем нагрева реакционной смеси до 80-90 °C.
Отжиг
Денатурированные (распущенные) ДНК/РНК обрабатывают праймерами — изготовленными в лабораторных условиях коротенькими цепочками нуклеиновых кислот. Благодаря запрограммированному участку, праймеры прикрепляются только к тем нуклеиновым кислотам, для которых были созданы. Например, праймер для вируса простого герпеса 1 типа, никогда не свяжется с ДНК другого вируса, микроорганизма или клетки.
Именно праймеры обусловливают крайне высокую специфичность ПЦР – способность реагировать только на нуклеиновые молекулы конкретных типов, видов классов и даже штаммов микроорганизмов. Или отдельные виды клеток живых организмов.
Элонгация
Или синтез. После завершения процесса отжига, в реакционной смеси создают условия для активности полимеразы. Фермент, ориентируясь на молекулы праймеров (а не исходных нуклеиновых кислот), начинает синтез новых ниток ДНК/РНК. Которые становятся копиями исходных, искомых молекул нуклеиновых кислот.
Такой температурный цикл проводится 30 и более раз. В результате, даже при изначально небольшом количестве искомого генетического материала, в реакционной смеси накапливается значительное число «помеченных» праймерами нуклеиновых кислот (растет экспоненциально, с удвоением при каждом цикле).Обнаружить большие количества ДНК/РНК намного проще, за счет чего реализуется еще одно преимущество ПЦР – высочайшая чувствительность.
Детекция
Оценка результатов ПЦР проводится несколькими путями:
- Электрофорез в вязкой среде. Суть в том, что ДНК/РНК заряжены электрически и движутся к одному из электродов. В среду (агар или полиакридный гель) добавляют краситель ДНК (например – бромистый этидий). В процессе сеанса электрофореза, молекулы нуклеиновых кислот движутся и формируют скопления, подкрашенные этидием. Под ультрафиолетом, это выглядит в виде полосок разной толщины и яркости.
- Метод гибридизации. Используются праймеры, заранее помеченные люминофором (флуорофором). После нужного числа температурных циклов, применяют специальный прибор – детектор флюоресценции. За счет того, что в образец можно добавлять флуорофоры для разных мишеней (они будут и светиться под ультрафиолетом разным цветом), метод гибридизации подходит для диагностики сразу нескольких мишеней в одном образце.
- ПЦР диагностика в реальном времени (real-time PCR). Отличается тем, что детекция проводится прямо в процессе амплификации. Для этого нужны зонды-люминофоры (из предыдущего пункта) и специальные приборы ДНК-амплификаторы. Эти устройства оценивают нарастание яркости люминофора после каждого температурного цикла и впоследствии, вычисляют исходное число искомых нуклеиновых кислот в образце.
Электрофорез и гибридизация подходят только для качественной оценки, то есть дают ответ на вопрос, есть ли в образце искомый материал. ПЦР в реальном времени – единственный доступный метод количественной оценки.
Если мишеней для праймеров в образце не окажется, то температурные циклы пройдут в холостую и при детекции будет получен отрицательный результат.
Преимущества методики ПЦР
Всего разработано более 10 разных методик амплификации, применяемых лабораториями в зависимости от исходных условий и поставленных целей.
Общим для них есть высокая чувствительность (для положительного результата достаточно 40 (!) или менее искомых копий ДНК в 1 мл образца, то есть вероятность ложноотрицательного ответа ничтожно мала. И очень высокая специфичность: вероятность ложноположительного ответа составляет менее 1%.
Но точность результатов сильно зависит от качества сбора диагностического материала, тщательного соблюдения всех технических требований к каждому этапу и качеству оборудования, расходных материалов (буфера, праймеров, раствора для отмывки и т.д.).
Области применения в медицине
В дерматовенерологии ПЦР используют для выявления венерических заболеваний: микоплазменной, хламидийной инфекций, сифилиса, генитального герпеса и др.
Инфекционисты активно используют ПЦР для диагностики туберкулеза, ВИЧ, вирусных гепатитов, герпеса, мононуклеоза, вируса Эпштейн-Барр и др.). А с помощью ПЦР в реальном времени, оценивая вирусную нагрузку, врачи могут составить мнение о динамике заболевания, отклике на лечение, что особенно актуально для пациентов с ВИЧ, принимающих терапию.
Также благодаря ПЦР врачи могут в течение нескольких дней с уверенностью идентифицировать коклюш и паракоклюш, выявить возбудителей эпидемии ОРВИ. Уточняются типы вируса гриппа, циркулирующие на определенной территории, на основании чего появляется возможность разработать эффективную вакцину для каждого сезона гриппа.
В течение суток или быстрее можно установить вид возбудителя кишечной инфекции, а значит – назначить адекватное лечение и обнаружить вероятный источник заражения.
Летом, ПЦР актуальна для диагностики заболеваний, передаваемых иксодовыми клещами: боррелиоза (болезни Лайма), клещевых энцефалитов.
Метод позволяет работать с любым биологическим материалом. Гемотрансмиссивные инфекции (сифилис, ВИЧ, гепатиты, боррелиоз) исследуются по пробе венозной крови или спинномозговой жидкости. Кожные болезни (герпес, грибки) – по соскобу с пораженного участка. Венерические и урологические – по образцу мочи, спермы, влагалищного отделяемого.
Так что в медицине, ПЦР применяется везде, где нужна высокая точность и быстрота получения результатов.
Лабораторные исследования, выполняющиеся методом ПЦР:
ПЦР диагностика скрытых инфекций
ПЦР диагностика скрытых инфекций или Полимеразная цепная реакция диагностика — высокоточный метод генной диагностики для выявления у пациента различного рода инфекционные и наследственные заболевания, как в хронической стадии, так и задолго до проявления болезни.
Какие инфекции можно выявить с помощью ПЦР-диагностики?
Учитывая весь спектр возбудителей, ПЦР-диагностика в современной медицине используется в урологии, гинекологии,дерматовенерологии, гастроэнтерологии и многих других отраслях медицины.
На данный момент ПЦР диагностика скрытых инфекций позволяет выявить следующие болезни:
2) Вирусные гепатиты А, В, С, G,Е
3) Инфекционный мононуклеоз (ДНК вируса Эпштейн-Барр -ВЭБ)
4) Цитомегаловирусная инфекция
5) Герпетическая инфекция
6) ИППП (инфекции, передающиеся половым путем) – уреаплазмоз, гарднереллез, хламидиоз, микоплазмоз, трихомониаз,микоплазмоз,кандидоз(Молочница)
8) Онкогенные вирусы – папилломавирусная инфекция (вирус папилломы человека)
9) Боррелиоз, клещевой энцефалит
12) Хеликобактерная инфекция
и многие другие
Стоимость ПЦР диагностики скрытых инфекций
| Наименование услуги | Цена (руб.) |
| Прием врача-терапевта первичный | 1800 руб. |
| Прием врача-терапевта повторный | 1300 руб. |
| Прием врача акушера-гинеколога первичный (к.м.н.; д.м.н.) | 1900 руб. |
| Прием врача акушера-гинеколога повторный (к.м.н.; д.м.н.) | 1400 руб. |
| Приём акушера- гинеколога первичный | 1800 руб. |
| Приём акушера- гинеколога повторный | 1300 руб. |
| Прием врача уролога-андролога первичный | 1800 руб. |
| Прием врача уролога-андролога повторный | 1300 руб. |
| Забор крови из вены | 300 руб. |
Список анализов на скрытые инфекции
| Код | Наименование исследования | Биологический материал | Результат | ****Срок испол. | Цена | ***CIT | Примечание |
| 010001 | ДНК Chlamydia trachomatis | соскоб из урогенитального тракта; секрет предстательной железы; моча | кач. | 1 к.д. | 300.00р. | 0 ₽ | |
| 010003 | ДНК Chlamydia trachomatis | соскоб из урогенитального тракта; моча; мазок из влагалища | кол. | 1-3 к.д. | 900.00р. | 0 ₽ | 0 |
| 010005 | ДНК Chlamydia trachomatis | отделяемое конъюнктивы глаз; мазок из ротоглотки | кач. | 1-3 к.д. | 500.00р. | 0 ₽ | 0 |
| Код | Наименование исследования | Биологический материал | Результат | ****Срок испол. | Цена | ***CIT | Примечание |
| 010101 | ДНК Mycoplasma hominis | соскоб из урогенитального тракта; секрет предстательной железы; моча | кач. | 1 к.д. | 300.00р. | 0 ₽ | 0 |
| 010104 | ДНК Mycoplasma hominis | соскоб из урогенитального тракта | кол. | 1-3 к.д. | 600.00р. | 0 ₽ | 0 |
| 010102 | ДНК Mycoplasma genitalium | соскоб из урогенитального тракта; секрет предстательной железы; моча | кач. | 1 к.д. | 300.00р. | 0 ₽ | 0 |
| 010110 | ДНК Mycoplasma genitalium | соскоб из урогенитального тракта; моча; мазок из влагалища | кол. | 1-3 к.д. | 900.00р. | 0 ₽ | 0 |
| 010107 | ДНК U.urealyticum / U. Parvum | соскоб из урогенитального тракта; моча; секрет предстательной железы | кач. | 1 к.д. | 300.00р. | 0 ₽ | 0 |
| 010109 | ДНК U.urealyticum / U. Parvum | соскоб из урогенитального тракта | кол. | 1-3 к.д. | 600.00р. | 0 ₽ | 0 |
| Код | Наименование исследования | Биологический материал | Результат | ****Срок испол. | Цена | ***CIT | Примечание |
| 010201 | ДНК Gardnerella vaginalis | соскоб из урогенитального тракта | кач. | 1 к.д. | 300.00р. | 0 ₽ | 0 |
| Код | Наименование исследования | Биологический материал | Результат | ****Срок испол. | Цена | ***CIT | Примечание |
| 010301 | ДНК Treponema pallidum | соскоб из урогенитального тракта | кач. | 1 к.д. | 300.00р. | 0 ₽ | 0 |
| Код | Наименование исследования | Биологический материал | Результат | ****Срок испол. | Цена | ***CIT | Примечание |
| 010401 | ДНК Neisseria gonorrhoeae | соскоб из урогенитального тракта; моча; секрет предстательной железы | кач. | 1 к.д. | 300.00р. | 0 ₽ | 0 |
| 010404 | ДНК Neisseria gonorrhoeae | соскоб из урогенитального тракта; моча; мазок из влагалища | кол. | 1-3 к.д. | 900.00р. | 0 ₽ | 0 |
ГРИБКОВЫЕ ИНФЕКЦИИ И ПРОСТЕЙШИЕ
| Код | Наименование исследования | Биологический материал | Результат | ****Срок испол. | Цена | ***CIT | Примечание |
| 020001 | ДНК Candida albicans | соскоб из урогенитального тракта | кач. | 1 к.д. | 300.00р. | 0 ₽ | 0 |
| Код | Наименование исследования | Биологический материал | Результат | ****Срок испол. | Цена | ***CIT | Примечание |
| 020101 | ДНК Toxoplasma gondii | спинномозговая жидкость; амниотическая жидкость | кач. | 1-3 к.д. | 500.00р. | 0 ₽ | 0 |
| 020102 | ДНК Toxoplasma gondii | кровь с ЭДТА | кач. | 1-3 к.д. | 500.00р. | 0 ₽ | 0 |
| Код | Наименование исследования | Биологический материал | Результат | ****Срок испол. | Цена | ***CIT | Примечание |
| 020201 | ДНК Trichomonas vaginalis | соскоб из урогенитального тракта; секрет предстательной железы; моча | кач. | 1 к.д. | 300.00р. | 0 ₽ | 0 |
| 020202 | ДНК Trichomonas vaginalis | соскоб из урогенитального тракта; моча; мазок из влагалища | кол. | 1-3 к.д. | 900.00р. | 0 ₽ | 0 |
| Код | Наименование исследования | Биологический материал | Результат | ****Срок испол. | Цена | ***CIT | Примечание |
| 030601 | ДНК Cytomegalovirus | соскоб из урогенитального тракта; моча | кач. | 1 к.д. | 300.00р. | 0 ₽ | 0 |
| 030603 | ДНК Cytomegalovirus | кровь с ЭДТА | кол. | 1-3 к.д. | 500.00р. | 0 ₽ | 0 |
| 030604 | ДНК Cytomegalovirus | кровь с ЭДТА (плазма) | кол. | 1-5 к.д. | 1200.00р. | 0 ₽ | 0 |
| 030605 | ДНК Cytomegalovirus | мазок из ротоглотки; амниотическая жидкость; спинномозговая жидкость | кол. | 1-3 к.д. | 600.00р. | 0 |
Вирус простого герпеса
| Код | Наименование исследования | Биологический материал | Результат | ****Срок испол. | Цена | ***CIT | Примечание |
| 030701 | ДНК Herpes simplex virus I/II типа | соскоб из урогенитального тракта | кач. | 1 к.д. | 300.00р. | 0 ₽ | 0 |
| 030702 | ДНК Herpes simplex virus I/II типа | кровь с ЭДТА | кач. | 1-3 к.д. | 500.00р. | 0 ₽ | 0 |
| 030703 | ДНК Herpes simplex virus 1/2 типа | мазок из ротоглотки; отделяемое пузырьковых высыпаний и эрозивно-язвенных поражений; спинномозговая жидкость | кач. | 1-3 к.д. | 600.00р. | 0 ₽ | 0 |
Вирус герпеса VI типа
| Код | Наименование исследования | Биологический материал | Результат | ****Срок испол. | Цена | ***CIT | Примечание |
| 030801 | ДНК Human herpes virus VI типа | мазок из ротоглотки; спинномозговая жидкость | кач. | 1-3 к.д. | 500.00р. | 0 ₽ | 0 |
| 030803 | ДНК Human herpes virus VI типа | кровь с ЭДТА | кол. | 1-3 к.д. | 500.00р. | 0 ₽ | 0 |
| Код | Наименование исследования | Биологический материал | Результат | ****Срок испол. | Цена | ***CIT | Примечание |
| 030901 | ДНК Epstein-Barr virus | мазок из ротоглотки; спинномозговая жидкость | кач. | 1-3 к.д. | 500.00р. | 0 ₽ | 0 |
| 030903 | ДНК Epstein-Barr virus | кровь с ЭДТА | кол. | 1-3 к.д. | 500.00р. | 0 ₽ |
Вирус Варицелла — Зостер
| Код | Наименование исследования | Биологический материал | Результат | ****Срок испол. | Цена | ***CIT | Примечание |
| 031001 | ДНК Varicella-Zoster virus | мазок из ротоглотки; спинномозговая жидкость; амниотическая жидкость | кач. | 1-3 к.д. | 500.00р. | 0 ₽ | 0 |
| 031002 | ДНК Varicella-Zoster virus | кровь с ЭДТА | кач. | 1-3 к.д. | 500.00р. | 0 ₽ | 0 |
| Код | Наименование исследования | Биологический материал | Результат | ****Срок испол. | Цена | ***CIT | Примечание |
| 031201 | ДНК ВПЧ 16 и 18 типов | у мужчин: уретра; крайняя плоть; у женщин: цервикальный канал; шейка матки | кач. | 1-3 к.д. | 300.00р. | 0 ₽ | 0 |
| 031203 | ДНК ВПЧ 6 и 11 типов | у мужчин: уретра; крайняя плоть; у женщин: цервикальный канал; шейка матки | кач. | 1 к.д. | 300.00р. | 0 ₽ | 0 |
| 031206 | ДНК ВПЧ высокого риска (16,18,31,33,35,39,45,51,52,56, 58,59,68 типы) | у женщин: цервикальный канал; шейка матки | кол. | 1-5 к.д. | 1000.00р. | 0 ₽ | 0 |
| 031207 | ДНК ВПЧ 16 и 18 типов | у женщин: цервикальный канал; шейка матки | кол. | 1-5 к.д. | 700.00р. | 0 ₽ | 0 |
| 031208 | ДНК ВПЧ высокого риска (16,18,31,33,35,39,45,51,52,56, 58,59,68 типы) | у мужчин: уретра; крайняя плоть; у женщин: цервикальный канал; шейка матки | кач. | 1-3 к.д. | 300.00р. | 0 ₽ | 0 |
| 031209 | ДНК ВПЧ высокого риска (16,18,31,33,35,39,45,51,52,56, 58,59 типы) | у мужчин: уретра; крайняя плоть; у женщин: цервикальный канал; шейка матки | ген. | 3-7 к.д. | 1500.00р. | 0 ₽ | 0 |
| 031210 | ВПЧ-тест расширенный (с определением количества и типа вируса) | соскоб из цервикального канала | комп. | 3-7 к.д. | 1500.00р. | 0 ₽ | 0 |
| 031211 | ВПЧ-ПАП-тест (комплекс тестов ВПЧ расширенный с определением количества и типа вируса и ПАП-тест) | соскоб из цервикального канала (стекло + пробирка) | комп. | 3-7 к.д. | 3500.00р. | 0 ₽ | 0 |
| 031212 | ВПЧ-ПАП-тест жидкостный (комплекс тестов ВПЧ расширенный с определением количества и типа вируса и ПАП-тест) | соскоб из цервикального канала жидкостный | комп. | 3-7 к.д. | 4000.00р. | 0 ₽ | 0 |
| 031213 | ВПЧ-тест расширенный жидкостный (с определением количества и типа вируса) | соскоб из цервикального канала жидкостный | комп. | 3-7 к.д. | 2000.00р. | 0 ₽ | 0 |
| 031214 | ПАП-тест жидкостный | соскоб из цервикального канала жидкостный | — | 3-7 к.д. | 3000.00р. | 0 ₽ | 0 |
| Код | Наименование исследования | Биологический материал | Результат | ****Срок испол. | Цена | ***CIT | Примечание |
| 032501 | РНК Zika virus | кровь с ЭДТА + слюна + моча | кач. | 1-5 к.д. | 4000.00р. | 0 ₽ | 0 |
| 032502 | РНК Zika virus | эякулят | кач. | 1-5 к.д. | 1500.00р. | 0 ₽ | 0 |
| 032503 | РНК Zika virus | амниотическая жидкость | кач. | 1-5 к.д. | 1500.00р. | 0 ₽ | 0 |
| Код | Наименование исследования | Биологический материал | Результат | ****Срок испол. | Цена | ***CIT | Примечание |
| 170401 | ДНК/РНК TBEV/B.burgdorferi sl/A.phagocytophillum/E.chaffeensis, E.muris | иксодовый клещ | кач. | 1-2 к.д. | 2000.00р. | 0 ₽ |
Как подготовится к ПЦР диагностике скрытых инфекций?
Подготовка к ПЦР диагностике скрытых инфекций является классической для большинства анализов. Для правильного анализа ПЦР диагностики скрытых инфекций нужно придерживаться следующих правил:
Расшифровку итогового анализа проводит ваш лечащий врач. Окончательные результаты будут готовы в течение 1-2 суток, в крайних случаях — в день сдачи анализов.
Записаться на ПЦР диагностику скрытых инфекций
Где сделать ПЦР диагностику скрытых инфекций в Москве?
В многопрофильном медицинском центре «ДокторСтолет» вы всегда можете сделать ПЦР диагностику скрытых инфекций (ЗППП). Наш медицинский центр расположен между станциями метро «Коньково» и «Беляево». Дорога от каждой из них займет не более 10 минут. Здесь Вас ждет высококвалифицированный персонал и самое современное диагностическое оборудование. Приятно удивят наших клиентов и вполне демократичные цены.
Майванди Рудольф Мухамедович
Главный врач.
Врач дерматовенеролог, уролог, андролог
Уролог — андролог первой категории.
Стаж работы: более 25 лет.
Ведет прием дерматовенерологических и урологических пациентов с различной патологией. Обследование, диагностика, консультация и лечение ИППП ,простатитов, уретритов ,циститов и т.д. Удаление кожных новообразований различными способами (Сургитрон,лазер,крио).
https://www.labquest.ru/articles/pcr-diagnostika/
https://doktorstolet.ru/articles/urologiya/ptsr-diagnostika-skrytykh-infektsiy/